一、使用前的准备工作

1. 确认灭菌条件与指示剂匹配

• 核对灭菌温度（121℃或 132℃）、灭菌时间及设备类型（如高压蒸汽灭菌锅、预真空灭菌柜），确保指示剂的耐热参数（如 D 值、芽孢浓度）与灭菌程序一致（例：121℃灭菌需选择标注 “121℃适用” 的型号）。

• 检查指示剂包装完整性：自含式指示剂需确认试管无裂纹、培养基无浑浊；芽孢条 / 片状指示剂需查看包装是否密封，避免受潮或污染。

2. 实验室环境与耗材准备

• 操作需在洁净区域（如超净工作台）进行，避免杂菌污染。

• 准备灭菌锅、培养箱（56±2℃，用于嗜热菌培养）、恒温培养振荡器（若需要）、无菌镊子、75% 乙醇等。

二、不同类型指示剂的使用步骤

1. 自含式生物指示剂（最常用）

操作流程

1. 放置指示剂：

• 将未拆封的自含式指示剂放入灭菌负载中（如灭菌包中央、最难灭菌的位置），避免直接接触灭菌锅内壁或蒸汽入口，以防局部过热或过湿。

2. 执行灭菌程序：

• 按常规操作启动灭菌锅，确保温度、压力、时间达到设定参数（例：121℃/15 分钟或 132℃/4 分钟）。

3. 激活与培养：

• 灭菌结束后，戴无菌手套取出指示剂，用 75% 乙醇擦拭试管外壁消毒。

• 捏碎或挤压试管底部的培养基安瓿（部分型号需折断顶部激活），使芽孢与培养基混合。

• 将试管放入 56±2℃培养箱，直立培养 48-72 小时（具体时间按说明书要求）。

4. 结果判读：

• 阳性（灭菌失败）：培养基变浑浊，表明芽孢未被杀灭。

• 阴性（灭菌成功）：培养基澄清透明，表明灭菌有效。

• 同时设置对照：每次检测需同步进行阳性对照（未灭菌的指示剂）和阴性对照（灭菌后的空培养基），确保结果可靠。

2. 芽孢条 / 芽孢悬液指示剂

操作流程

1. 制备与放置：

• 芽孢条：将吸附芽孢的滤纸条放入透气性包装（如无纺布袋），置于灭菌柜内不同位置（按验证方案布点）。

• 芽孢悬液：取适量悬液（含 1×10?-5×10? CFU）滴在无菌载体上，放入灭菌负载中。

2. 灭菌与取样：

• 完成灭菌后，用无菌镊子取出芽孢条 / 载体，避免接触非无菌区域。

3. 接种与培养：

• 将芽孢条放入无菌肉汤培养基（如胰酪大豆胨培养基）中，或用无菌生理盐水洗脱载体上的芽孢，接种至培养基。

• 培养基在 56±2℃培养 48-72 小时，观察是否浑浊。

4. 结果记录：

• 需详细记录各布点的培养结果，用于灭菌柜的热分布分析（如是否存在冷点）。

3. 片状生物指示剂

操作流程

1. 放置位置：

• 将片状指示剂放入灭菌包的中心或最难灭菌处（如模拟医疗器械的缝隙、包装内部）。

2. 灭菌与回收：

• 灭菌后取出片状指示剂，用无菌剪刀剪取部分载体，放入培养基中培养（操作同芽孢条）。

3. 注意事项：

• 片状指示剂的载体材质（如无纺布、金属片）需与灭菌负载兼容，避免影响灭菌效果。

三、关键操作要点与注意事项

1. 布点原则

• 日常监测：将指示剂放在灭菌锅的 “冷点”（如底部角落、排气口附近），因该区域灭菌效果可能最弱。

• 验证试验：按 ISO 11138-3 标准布点，需覆盖灭菌柜的上、中、下、四角及中心位置，至少放置 10 个指示剂（根据设备容积调整）。

2. 培养条件严格控制

• 嗜热脂肪芽孢杆菌的最适生长温度为 56℃左右，培养箱温度偏差需≤±2℃，避免因温度过低导致芽孢不生长（假阴性）或过高导致杂菌滋生（假阳性）。

• 培养过程中保持培养基密封，避免污染。

3. 无菌操作规范

• 所有接触指示剂的操作需在无菌环境下进行，镊子、剪刀等工具需提前灭菌（如干热灭菌 160℃/2 小时）。

• 自含式指示剂激活时，避免手指接触试管内部或培养基，以防外源微生物污染。

4. 异常情况处理

• 重复检测，确认是否为操作失误（如灭菌参数设置错误、培养污染）。

• 若多次阳性，需对灭菌设备进行故障排查（如蒸汽饱和度、压力波动）。

• 若培养后指示剂出现浑浊（阳性），需：

四、行业合规与记录要求

1. 数据记录

• 每次使用需填写《生物指示剂使用记录》，内容包括：指示剂批号、灭菌日期、温度 / 时间、培养结果、操作人员签字等，记录需保存至少 3 年（如 GMP 要求）。

2. 验证文件支持

• 灭菌工艺验证（如 PQ）时，需将指示剂检测结果纳入验证报告，附培养前后的照片、活菌计数数据及 D 值分析，确保符合 FDA、NMPA 等监管要求。

五、常见错误与风险规避

• 错误 1：指示剂放置位置不当
  ? 后果：若放在灭菌锅边缘，可能因温度不足导致假阳性（芽孢未被杀灭）。
  ? 规避：按灭菌设备的热分布报告确定冷点，优先放置指示剂。
• 错误 2：培养温度错误
  ? 后果：若用 37℃培养（适用于枯草芽孢杆菌），嗜热菌生长缓慢或不生长，导致假阴性。
  ? 规避：严格使用 56±2℃培养，可选择带温度报警功能的培养箱。
• 错误 3：忽略阳性 / 阴性对照
  ? 后果：无法判断结果有效性（如培养基自身污染导致假阳性）。
  ? 规避：每次检测必须设置对照，阳性对照应 100% 生长，阴性对照应无菌生长，否则试验无效。

总结：使用流程简表

1. 确认灭菌参数 → 2. 选择指示剂类型并检查包装 → 3. 按布点原则放置指示剂 → 4. 执行灭菌程序 → 5. 无菌操作取出指示剂 → 6. 激活 / 接种培养基 → 7. 56℃培养 48-72 小时 → 8. 对比对照判读结果 → 9. 记录数据并归档。

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