孢子溶解：取冻干孢子粉，加入无菌 0.05% 吐温 - 80 生理盐水（吐温 - 80 可降低孢子表面张力，防止孢子团聚，保证浓度均匀），涡旋振荡 1 分钟，制成孢子悬液。
初步培养：将孢子悬液接种至 PDA 斜面，30℃培养 48 小时，待斜面长出白色绒毛状菌丝后，挑取少量菌丝转接至新鲜 PDA 平板。
孢子扩增：30℃培养 7-10 天，直至平板表面布满暗绿色孢子，此时孢子浓度可达 10?-10? CFU/mL，可用于后续实验或浓度校准。
浓度校准：采用 “血球计数板法 + 涂布计数法” 双重验证。取 1mL 孢子悬液，用 0.05% 吐温 - 80 生理盐水 10 倍梯度稀释至 10??、10??，取 0.1mL 涂布 PDA 平板（每个稀释度 3 个平行），30℃培养 5 天计数，计算平均菌落数与孢子浓度，误差需控制在 ±0.2 log 内；若误差超范围，需排查孢子溶解不充分（未加吐温 - 80 或振荡时间不足）、稀释吸管污染或培养温度波动等问题。
形态与生化鉴别：
显微镜观察：取少量菌丝与孢子，用乳酸酚棉蓝染色，显微镜下可见分支状分隔菌丝，顶囊呈球形，小梗双层排列（上层小梗短，下层小梗长），分生孢子呈球形、表面粗糙，这是巴西曲霉菌的典型形态特征，可与其他曲霉菌（如黄曲霉菌顶囊呈烧瓶形）鉴别。
生化特性：不发酵糖类，能利用蔗糖、葡萄糖作为碳源，不能利用乳糖；在查氏培养基上生长良好，可进一步确认菌株身份。
个人防护：人员需穿全包裹式防护服、戴 N95 口罩（防止孢子吸入）及护目镜（避免孢子接触眼睛黏膜），操作前后需用 75% 乙醇消毒手部与防护服表面。
环境消毒：实验结束后，用 0.5% 过氧乙酸对生物安全柜内部喷雾消毒（重点消毒气流格栅与操作台面），作用 20 分钟后用无菌水擦拭，再开启紫外灯照射 30 分钟，彻底清除残留孢子；实验室每周用甲醛熏蒸消毒 1 次，防止孢子扩散至外部环境。
废弃物处理：含菌培养物（如 PDA 菌落、孢子液）需 121℃高压灭菌 60 分钟（孢子耐高温，需比细菌延长 30 分钟，确保彻底杀灭）；含孢子废液需先加入等量 10% 次氯酸钠溶液，室温静置 60 分钟（破坏孢子细胞壁结构）后再灭菌；实验耗材（如培养皿、吸头）需装入耐高温灭菌袋，灭菌后按医疗有害废弃物处理，不可与普通垃圾混放。
沙土管保存法（推荐）：取灭菌沙土（颗粒直径 0.2-0.5mm）装入试管，加入适量孢子悬液，振荡使孢子均匀吸附在沙土表面，室温干燥后密封试管，4℃冷藏存放，保质期可达 8-10 年，孢子存活率≥85%。该方法能最大限度保留孢子活性，且操作简便，适合长期批量存储。
-80℃冷冻保存法：将孢子悬液与 50% 无菌甘油按 1:1 混合（甘油终浓度 25%，防止冷冻过程中形成冰晶损伤孢子），分装为 1mL / 支的冻存管，快速放入 - 80℃冰箱（避免缓慢冷冻），冻存次数不超过 3 次（反复冻融会导致孢子萌发率下降至 50% 以下），保质期 3-4 年。
存储管理：需单独存放于双锁生物安全冰箱的真菌专属区域，与细菌菌株严格分区（避免交叉污染），标签需注明 “巴西曲霉菌（ATCC16404，WDCM 00053）”“非产毒”“存储日期”，实行双人双锁领用制度，领用记录需详细注明用途（如 “抗真菌测试”“药品真菌计数”），确保菌株不被滥用。
客服1