芽孢活化：取冻干芽孢粉，加入无菌生理盐水（无需添加表面活性剂，芽孢无团聚特性），涡旋振荡 30 秒，制成芽孢悬液；将悬液置于 80℃水浴中热休克 10 分钟（唤醒休眠芽孢，提高萌发率，若省略此步骤萌发率会降至 40% 以下），迅速冷却至室温。
初步培养：取活化后的芽孢悬液 1mL，接种至 50mL 芽孢形成液体培养基，37℃、180rpm 振荡培养 24 小时，此时菌体进入稳定期，芽孢形成率达 60%-70%。
芽孢扩增与纯化：取上述培养液涂布芽孢形成琼脂平板，37℃培养 48 小时，挑取表面粗糙、中心凹陷的单个菌落，转接至新鲜平板培养 72 小时，待芽孢完全成熟（显微镜观察芽孢占比≥90%），用无菌生理盐水洗脱平板表面芽孢，制成高浓度芽孢悬液（浓度可达 10?-10? CFU/mL）。
浓度校准：采用 “涂布计数法 + 芽孢染色计数法” 双重验证。取 1mL 芽孢悬液，用无菌生理盐水 10 倍梯度稀释至 10??、10??，取 0.1mL 涂布营养琼脂平板（每个稀释度 3 个平行），37℃培养 24 小时计数，计算平均菌落数与芽孢浓度，误差需控制在 ±0.2 log 内；同时，取稀释后的芽孢悬液进行孔雀绿芽孢染色，显微镜下计数芽孢占比，需≥90%，否则需延长培养时间。若浓度误差超范围，需排查热休克温度 / 时间不当、稀释吸管污染或振荡培养转速不足等问题。
形态与生化鉴别：
显微镜观察：革兰氏染色呈阳性短杆状，芽孢染色后可见绿色椭圆形芽孢（位于菌体中央或次末端，不膨大），与其他芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌芽孢多位于菌体中央且略膨大）鉴别。
生化特性：能发酵葡萄糖、蔗糖产酸不产气，不发酵乳糖；触酶阳性，氧化酶阴性；能在 7% NaCl 培养基中生长，45℃环境下可正常繁殖，这些特性可进一步确认菌株身份。
个人防护：人员佩戴无菌手套、一次性口罩与实验服，操作前后用 75% 乙醇消毒手部，无需穿防护服或护目镜（与 BSL-2 级真菌操作差异显著）。
环境消毒：实验结束后，用 0.2% 含氯消毒剂擦拭超净台台面与实验器具，开启紫外灯照射 30 分钟；若发生芽孢悬液泄漏，用浸有含氯消毒剂的纱布覆盖 30 分钟后清理，防止芽孢扩散。
废弃物处理：含菌培养物（如培养基、芽孢悬液）需 121℃高压灭菌 30 分钟（芽孢耐高温，需比普通细菌延长 10 分钟，确保彻底杀灭）；实验耗材（如培养皿、吸头）灭菌后按普通废弃物处理，无需按医疗有害废弃物分类。
沙土管保存法（推荐）：取灭菌沙土（颗粒直径 0.3-0.6mm）装入 10mL 试管，加入 2mL 高浓度芽孢悬液，振荡使芽孢均匀吸附，室温通风干燥后密封试管，4℃冷藏存放，保质期可达 8-10 年，芽孢存活率≥90%，该方法成本低、操作简便，适合大批量菌株存储。
-80℃冷冻保存法：将芽孢悬液与 50% 无菌甘油按 1:1 混合（甘油终浓度 25%，防止冷冻损伤），分装为 1mL / 支的冻存管，快速放入 - 80℃冰箱（避免缓慢冷冻导致芽孢细胞膜破裂），冻存次数无严格限制（反复冻融 5 次内存活率仍≥80%），保质期 3-4 年，适合短期频繁使用的场景。
存储管理：可与其他 BSL-1 级细菌同区域存放于普通双锁冰箱，无需单独划分专属区域（与真菌存储要求差异显著）；标签注明 “斯皮兹泽芽孢杆菌（ATCC6633，WDCM 00003）”“芽孢悬液”“存储日期”，建立领用台账，记录领用用途（如 “消毒验证”“热加工工艺测试”），管理难度远低于高风险微生物。
客服1